在生命科学研究中，光学显微镜的应用非常广泛。以至少单细胞精度对全器官/组织进行整体的三维结构/功能成像是当前光学显微技术研究的一大热点，其进展对于神经科学、解刨学、病理学等领域的研究有着重要的推动作用。现有的三维显微成像技术，如共聚焦、双光子显微镜，多受制于有限的光学通量，无法避免成像速度与空间分辨率之间的妥协，难以做到快且精准。因此，在对宏观尺度的全器官/组织进行高分辨率成像时，操作繁琐，单个样本的图像采集往往已耗时极长，使得大规模的对比筛选实验难以开展。

    针对上述问题，此前华中科技大学费鹏课题组在Optica上报道了基于深度学习的三维超分辨方法【1】，将显微镜成像通量提高近两数量级。但深度学习方法需预先获取大量高质量标签图像用于监督训练，且特定网络适用于特定类型显微图像，泛化能力较有限。

    2021年1月4日，华中科技大学光学与电子信息学院费鹏课题组进一步联合武汉光电国家研究中心朱䒟及华中科技大学附属同济医院梅伟课题组，在Nature Communications上发表了题为“Minutes-timescale 3D isotropic imaging of entire organs at subcellular resolution by content-aware compressed-sensing light-sheet microscopy”的研究论文 ，提出一种自监督的三维压缩感知算法，结合一种大视场贝塞尔光片显微镜技术，实现高通量的全组织整体三维成像。

    该研究首先在光学上实现了大视场下的均匀贝塞尔型光片照明，可对数毫米至数厘米尺寸经快速透明化处理的样本进行仅1至3微米厚的光学层析激发，使自行研制的光片显微镜在硬件上具备各向同性三维成像的能力。在图像处理方面，该研究提出了一种根据荧光信号局部稀疏特性自动调整约束参数的压缩感知算法（content aware compressive sensing, CACS），可对大规模、高动态范围图像进行三维分辨率增强。将两者结合后，大视场贝塞尔光片显微镜可在较低倍率下仅需数分钟即获取组织的整体三维图像，再经CACS算法复原，快速重建出全组织的高分辨版本图像。

    下图1展示了对一个约10 × 8 × 5立方毫米的小鼠全脑（绿色荧光蛋白标记神经元）进行成像、分辨率增强，及定量分析的整体工作流程。原始低分辨图像由使用3倍物镜探测的贝塞尔光片显微镜以每秒40帧的速度和2微米的粗扫描步长拍摄，仅需5-10分钟即可得到完整的三维全脑数据 （图1a1-2）。相较使用12倍物镜，以5帧每秒速度和0.5微米精细扫描步长获取高分辨、高信噪比全脑图像，成像时间则需超过1000分钟。原始图像约4.5微米的各向同性分辨率对于有高精度要求的单神经元追踪尚显不足，后续压缩感知算法则以信号的稀疏性作为先验知识，无需训练过程，仅需单组原始图像输入即可复原出分辨率增强的图像 （图1a3）。针对常规压缩感知在处理大范围分布不均匀信号时常出现过拟合（丢失信号）或欠拟合（出现伪影）的问题，该研究提出的自适应式压缩感知算法可从局部图像中提取信号密度和无序度特征参数，作为反馈优化压缩感知计算的约束条件，从而可根据不同区域信号特征的不同，自适应地提供最优的复原结果(图1b)。引入图像内容自监督后的算法显著改善大尺度样本中因信号分布不均匀产生的伪影/信号丢失等问题，将低分辨、低信噪比图像可靠地提升至高分辨图像的水准（图1c）。该压缩感知光片显微镜技术在同等分辨率下，将全脑成像的时间从十几小时缩短至数分钟，通量较目前三维荧光显微镜提升至少两个数量级（图1e）。同时，重建出的各向同性高分辨率图像（0.5微米体像素）可提供亚细胞精度的神经元结构信息，开展有效的神经追踪分析 （图1d）。

图1. 压缩感知光片显微镜技术实现分钟级快速小鼠全脑神经元成像

   其次，研究者还将该技术应用于对细胞核标记的小鼠半脑的成像（图2）。原始图像采集时间仅约6分钟（图2a），经压缩感知复原后的三维图像可清晰分辨密集排布的单个细胞核（图2b-c），进而支持脑区分割、细胞计数等分析工作（图2d-h）。研究者基于重建的三维图像将半脑划分成10个子脑区，并与艾伦标准脑图谱（Allen Brain Atlas）配准，最终展示了对每个脑区的体积和脑区内细胞数量的统计分析（图2i-j）。

图2. 基于压缩感知光片显微镜技术的小鼠脑细胞图谱可视化和分区细胞计数

    论文还展示了技术在双色标记的小鼠神经-肌肉成像上的应用（图3）。研究者在数分钟内对标记了神经元和运动终板（MEP）的小鼠腓肠肌和胫前肌进行成像（图3a-d）。这种快速、低精度测量模式下得到的大视野图像可用于初步筛选，统计不同肌肉内MEP的数目和密度（图3f）。在结合使用压缩感知增强后，可进一步分辨单个神经肌肉接头的细节（图3e）。通过对双色信号的分别统计，计算出单个神经肌肉接头内突触前神经在突触后运动终板中的体积占比（图3g）。综合低、高分辨率模式下获得的分析结果可对肌肉运动能力的评估提供重要参考。

图3. 双色压缩感知光片成像揭示小鼠肌肉中运动终板分布及神经肌肉接头细节

    简言之，该研究改进了传统的压缩感知算法，并发展出大视场贝塞尔光片显微镜技术，两者的结合显著提升了三维荧光成像的通量，解决了以往开展大规模组织三维成像极难的问题。硬件上通过新型显微镜可快速获取各向同性分辨率的原始三维图像，软件上自适应压缩感知方法可进一步增强分辨率，且无需数据训练，对荧光信号具有高适用性。通过小鼠全脑神经元成像和追踪，小鼠脑细胞构筑的可视化和分区计数，小鼠肌肉整体成像及神经肌肉接头细节分析这三个应用演示，该技术在全器官/组织成像中的优越性能得到充分体现。同时，基于通用计算的图像复原算法亦适用于增强共聚焦、双光子等商业化三维显微镜，方法具有较高的传播性和兼容性。

    华中科技大学光学与电子信息学院博士研究生方春钰，武汉国家光电研究中心副研究员俞婷婷为论文共同第一作者。华中科技大学光学与电子信息学院费鹏教授，武汉光电国家研究中心朱䒟教授和华中科技大学附属同济医院梅伟教授为论文共同通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-020-20329-3

参考文献：

1. https://doi.org/10.1364/OPTICA.402046